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精编细胞生物学实验指南


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精编细胞生物学实验指南
  • 书号:9787030175793
    作者:章静波等
  • 外文书名:Short Protocols in Cell Biology
  • 丛书名:生命科学实验指南系列
  • 装帧:平装
    开本:16
  • 页数:838
    字数:1242000
    语种:zh-Hans
  • 出版社:科学出版社
    出版时间:2007-01-01
  • 所属分类:
  • 定价: ¥258.00元
    售价: ¥206.40元
  • 图书介质:
    纸质书

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本书内容翔实全面,主要包括:细胞培养、细胞的制备与分离、亚细胞组分分离和细胞器分离、抗体、显微镜技术、细胞蛋白质的特性、电泳与免疫印迹、蛋白标记和免疫沉淀、蛋白质的磷酸化作用、蛋白质转运,以及细胞增殖、衰老和死亡、体外重建、细胞黏附和细胞外基质、细胞的能动性、细胞器运动。全书还附有各种实用信息和数据,包括试剂与溶液的配制、细胞生物学研究中常用的药物概要和各种常用技术的介绍等。
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    译者序
    前言
    第1章 细胞培养 1
    单元1.1 哺乳动物细胞培养的基本方法 2
    基本方案 单层细胞的胰酶消化和传代 2
    备择方案 悬浮培养的细胞传代 3
    支持方案1 人中层贴壁细胞的冻存 3
    支持方案2 悬浮细胞的冻存 4
    支持方案3 人细胞系的解冻与复苏 4
    支持方案4 用血细胞计数板和台盼蓝染色法测定细胞数目及活性 4
    支持方案5 细胞运输的准备 5
    单元1.2 适于哺乳动物细胞的培养基 6
    基本方案1 制备含血清的培养基 6
    基本方案2 制备血清减量或无血清培养基 7
    基本方案3 HAT选择培养基的制备 8
    基本方案4 转化细胞在软琼脂中的生长 9
    支持方案1 培养基中pH的调节 9
    支持方案2 抗生素在培养基中的应用 10
    单元1.3 细胞培养的无菌技术 11
    基本方案1 无菌技术 11
    基本方案2 层流式超净台的使用 12
    单元1.4 灭菌和过滤 13
    基本方案1 液体的高乐灭菌 14
    备择方案 干燥物品的高压消毒 15
    基本方案2 干热灭菌和清除热原法 16
    基本方案3 消毒剂的应用:70%乙醇 16
    溶液的过滤除菌 17
    基本方案4 真空过滤 17
    基本方案5 小体积非水溶性液体的正压过滤 18
    单元1.5 确定和控制细胞培养的微生物污染 19
    基本方案1 细菌和真菌污染的检测 19
    基本方案2 直接培养法检测支原体污染 21
    基本方案3 应用抗生素控制微生物污染 23
    单元1.6 酵母培养及培养基 24
    培养基的制备 24
    酵母培养的综合考虑 30
    第2章 细胞的制备与分离 35
    单元2.1 成纤维细胞培养的建立 36
    基本方案 36
    单元2.2 人淋巴细胞的制备和培养 40
    基本方案1 通过高分子质量的蔗糖-泛影钠(Ficoll-Hypaque)梯度离心制备淋巴细胞 40
    基本方案2 从淋巴细胞群里制备单核/巨噬细胞和树突状细胞 42
    基本方案3 通过包被在磁珠表面的单克隆抗体分选T细胞和B细胞 42
    单元2.3 人脐静脉内皮细胞的制备 44
    基本方案 44
    单元2.4 转染EB病毒产生永生的B细胞株 45
    基本方案 45
    单元2.5 激光捕获显微切割 46
    基本方案 从组织切片中分离一种纯的细胞群 47
    支持方案 苏木素和伊红染色组织的激光显微切割 49
    第3章 亚细胞组分分离和细胞器分离 50
    单元3.1 细胞组分分离概述 51
    单元3.2 分离大鼠肝细胞质膜片层与浆膜结构域 59
    基本方案1 分离质膜片层 59
    支持方案1 检测碱性磷酸二酯酶I的活性 61
    基本方案2 分离质膜结构域 63
    支持方案2 K+激活的对硝基苯酚磷酸酯酶活性測定实验 63
    支持方案3 5'-核苷酸酶活性测定实验 64
    支持方案4 间接免疫荧光法检测与质膜片层相连的蛋白质 65
    单元3.3 利用差速及密度梯度离心法从组织和细胞中分离Golgi膜 66
    基本方案1 利用蔗糖密度筛从大鼠肝脏中快速分离Golgi膜 67
    基本方案2 将大鼠肝脏提取的轻线粒体组分悬浮于非连续的蔗糖梯度液中来分离Golgi膜 68
    基本方案3 将培养的细胞悬浮于非连续的蔗糖梯度液中来分离Golgi膜 69
    基本方案4 用白发形成梯度的IODIXANOL梯度液从肝细胞微粒体组分中分离Golgi膜 70
    支持方案 测定UDP-半乳糖半乳糖基转移酶 71
    单元3.4 利用差速离心及密度梯度离心从组织及细胞中分离溶酶体 72
    基本方案1 使用白发形成梯度的PERCOLL梯度液从大鼠肝脏中分离溶酶体 72
    基本方案2 利用自发形成梯度的PERCOLL梯度液从培养的人HIJ-60细胞中分离溶酶体 74
    支持方案1 酸性磷酸酶的测定 75
    支持方案2 β-N乙酰葡糖胺酶的测定 76
    单元3.5 差速离心法从组织和细胞中分离线粒体 76
    基本方案1 用大鼠肝脏制备重线粒体组分 77
    基本方案2 中心脏线粒体的大量制备 78
    基本方案3 用骨骼肌制备线粒体 79
    基本方案4 用培养的细胞制备线粒体 80
    基本方案5 用酵母菌(酿酒酵母)制备线粒体 80
    单元3.6 密度梯度离心法纯化粗线粒体组分 81
    基本方案1 用连续蔗糖梯度液分离大鼠肝脏的线粒体组分 82
    基本方案2 用非连续PERCOLL梯度液从大鼠脑分离线粒体 83
    基本方案3 用自发形成梯度的PERCOLL梯度液分离线粒体组分 84
    支持方案1 线粒体的琥珀酸脱氢酶分析 84
    支持方案2 溶酶体的β-半乳糖苷酶分析 85
    支持方案3 过氧化物体的过氧化氢酶分析 86
    单元3.7 用差速离心法和密度梯度离心法从组织和细胞中分离过氧化物体 86
    基本方案1 从大鼠肝脏分离轻线粒体组分 87
    基本方案2 用预先形成的连续IODIXANOL梯度液分离大鼠肝脏轻线粒体组分中的过氧化物体 88
    基本方案3 用预先形成的连续NYCODENZ梯度液分离大鼠肝脏轻线粒体组分中的过氧化物体 89
    基本方案4 用预先形成的连续NYCODENZ梯度液从酵母原生质体分离过氧化物体 90
    基本方案5 用预先形成的连续NYCODFNZ梯度液从培养细胞(HcpG2)分离过氧化物体 91
    支持方案 内质网标志酶NADPH细胞色素c还原酶的分析 92
    单元3.8 从哺乳动物组织中分离细胞核及核膜 93
    基本方案1 使用蔗糖密度筛从大鼠肝组织匀浆中分离细胞核 93
    备择方案 使用IODIXANOL梯度液从动物或植物(麦芽)细胞中分离细胞核 94
    基本方案2 分离细胞核膜:高离子强度的方法 95
    基本方案3 分离细胞核膜:低离子强度的方法 96
    支持方案1 二苯胺检测DNA 97
    支持方案2 苔黑素测定RNA 97
    支持方案3 溴化乙锭测定RNA及DNA 98
    单元3.9 酿酒酵母的亚细胞组分分离 99
    基本方案1 利用差速离心法分离原生质体组分 111
    支持方案 应用酶解酶制备酵母原生质体 113
    基本方案2 应用NYCODFNZ进行平衡密度梯度组分分离 114
    基本方案3 在蔗糖分级梯度液中进行P13000膜的组分分离 116
    基本方案4 应用FICOLL分级梯度液分离完整的囊泡 118
    基本方案5 应用FICOLL分级梯度液分离完整的细胞核 120
    基本方案6 应用NYCODENZ分级梯度液分离乳糖诱导的线粒体 124
    基本方案7 用蔗糖分级梯度液分离油酸盐诱导的过氧化物酶体 127
    基本方案8 用蔗糖分级梯度液分离内质网 129
    基本方案9 用蔗糖分级梯度液从完整的酵母细胞中分离质膜 131
    基本方案10 从完整的酵母细胞中分离细胞溶胶 132
    第4章 细胞生物学研究的工具——抗体 135
    单元4.1 单克隆抗体的制备 136
    基本方案1 制备单克隆抗体的免疫方法 136
    基本方案2 细胞融合与杂交瘤细胞的选择 137
    支持方案1 筛选原始杂交瘤上清 140
    支持方案2 杂交瘤细胞系的建立 140
    支持方案3 用有限稀释法进行克隆化培养 141
    支持方案4 制备克隆化/扩增培养基 142
    单元4.2 多克隆抗体的制备 142
    基本方案 用弗式佐剂免疫产生多克隆抗体 142
    备择方案 用其他佐剂免疫产生多克隆抗血清 144
    支持方案 血清的制备 145
    单元4.3 免疫球蛋白G的纯化 115
    基本方案1 硫酸铵沉淀和分子筛层析 145
    基本方案2 蛋白A葡聚糖亲和层析 116
    备择方案1 蛋白G葡聚糖亲和层析 148
    备择方案2 抗大鼠k链单克隆抗体结合的葡聚糖亲和层析 118
    基本方案3 以Tris·Cl为缓冲液的DE52离子交换层析 149
    单元4.4 抗体缀合物用于细胞生物学研究 I50
    基本方案 抗体与荧光团或生物素的结合 150
    支持方案 估计抗体浓度的方法 155
    第5章 显微镜术 156
    单元5.1 光学显微镜的校准及调节 157
    光学显微镜的主要部件 158
    亮视场与荧光显微镜术成像及Kohler照明光路的基础知识 162
    基本方案1 亮视场,透射显微镜术的Kohler照明校准 164
    基本方案2 目镜的校准 166
    基本方案3 表面荧光显微镜Koh1er照明模式的校准 166
    基本方案4 相差显微镜术的校准 167
    支持方案 显微镜光学部件的维护及清洗 169
    单元5.2 荧光显微镜术 170
    荧光显微镜光学系统 170
    荧光显微镜部件 171
    数字化暗室 174
    单元5.3 免疫荧光染色 175
    基本方案 培养细胞的免疫荧光标记 175
    单元5.4 荧光染料及荧光脂类衍生物标记细胞器 177
    基本方案1 同定细胞的内质网染色 179
    备择方案 活细胞内内质网染色 180
    基本方案2 活细胞内高尔基复合体染色 180
    基本方案3 线粒体染色 182
    单元5.5 基本共聚焦显微镜术 183
    光切基础 183
    共聚焦显微镜的类型 181
    应用指南 187
    单元5.6 用免疫过氧化物酶方法定位培养细胞和组织的抗原 191
    计划策略 192
    基本方案1 培养细胞的免疫过氧化物酶染色 192
    基本方案2 组织的免疫过氧化物酶染色 194
    单元5.7 低温免疫金电子显微镜技术 196
    基本方案 免疫金标记 197
    支持方案1 用免疫金标记方法同定细胞 198
    支持方案2 用免疫金标记方法固定组织 198
    支持方案3 免疫金标记方法做冰冻切片 199
    支持方案4 经碳聚乙烯醇缩甲醛和氯乙聚乙烯醇三元共聚物处理的铜栅格的准备 200
    单元5.8 相关的视频光学/电子显微镜术 201
    基本方案 相关的视频光学/电子显微镜术 201
    单元5.9 活细胞内微管和肌动蛋白丝的荧光斑点显微镜技术(FSM) 205
    计划策略 205
    基本方案1 设计一个时延数字化FSM显微镜系统 206
    基本方案2 活细胞内细胞骨架的时延FSM成像 210
    基本方案3 时延FSM系列影像的定性和定量分析 212
    支持方案1 FSM荧光标记的微管蛋白的制备 213
    支持方案2 FSM荧光标记肌动蛋白的制备 216
    单元5.10 作为活细胞影像工具的GFP 219
    制备融合蛋白 219
    第6章 细胞蛋白质的特性 225
    单元6.1 膜结合蛋白质的分析 226
    基本方案1 碱性碳酸盐提取 226
    备择方案1 尿素提取 227
    备择方案2 高盐提取 227
    备择方案3 Triton X-114相位分离 227
    支持方案 Triton X-114预浓缩 228
    基本方案2 磷脂酰肌醇磷脂酶(PI-PLC)水解GPI结合蛋白 228
    基本方案3 Triton X-100对不溶性整合膜蛋白和GPI结合蛋白的增溶作用 229
    单元6.2 蔗糖密度梯度区带沉淀法测定分子质量 230
    基本方案1 利用梯度自动形成仪制备蔗糖梯度的区带离心 231
    备择方案1 用简易梯度形成仪制备蔗糖梯度的区带离心 232
    支持方案1 普通分子质量标志物的应用和制备 231
    基本方案2 穿刺法分部收集样品 235
    备择方案2 管底穿刺蠕动洗脱分离法 236
    支持方案2 沉降系数的计算 236
    单元6.3 体积排阻层析法(凝胶过滤)测定分子质量 237
    设计策略 238
    基本方案1 体积排阻高效液相层析(SE-HPLC) 239
    基本方案2 常规体积排阻层析(SEC) 241
    第7章 电泳与免疫印迹 244
    单元7.1 蛋白质的单向SDS凝胶电泳 246
    基本方案 变性(SDS)不连续凝胶电泳:Lacmmli凝胶法 248
    备择方案1 Tris-tricine缓冲液系统的电泳 252
    备择方案2 在梯度凝胶中分离蛋白质 251
    单元7.2 非变性条件下的单向凝胶电泳 256
    基本方案 非变性聚丙烯酰胺连续电泳 256
    备择方案 非变性不连续凝胶电泳以及分子质量标准曲线的绘制 260
    单元7.3 双向凝胶电泳 261
    基本方案1 高分辨率的平衡柱凝胶等电聚焦电泳 262
    支持方案1 pH特性的测定 261
    备择方案1 极端酸性蛋白的非平衡等电聚焦电泳 265
    备择方案2 极端碱性蛋白的非平衡等电聚焦 265
    支持方案2 细胞抽提物的等电聚焦 266
    基本方案2 IEF柱凝胶的第二向电泳 267
    支持方案3 标准分子质量蛋白质的双向凝胶 268
    备择方案3 对角线凝胶电泳(非还原/还原凝胶) 269
    单元7.4 蛋白质单向平板凝胶等电聚焦电泳 270
    基本方案 变性平板凝胶等电聚焦电泳 270
    支持方案 变性等电聚焦平板凝胶的电转印 271
    单元7.5 蛋白质的琼脂糖凝胶 271
    基本方案 琼脂糖凝胶电泳和印迹的免疫检测 271
    单元7.6 凝胶中蛋白质的染色 273
    基本方案1 考马斯亮监染色 273
    备择方案 等电聚焦后进行考马斯亮蓝染色 271
    基本方案2 银染法 274
    基本方案3 蛋白质凝胶的荧光检测 276
    基本方案4 可逆蛋白锌染法 277
    单元7.7 免疫印迹和免疫检测 277
    基本方案1 用转移槽转印蛋白质 278
    备择方案1 用半干转移系统转印蛋白质 279
    支持方案1 转印后蛋白质的叮逆染色 280
    基本方案2 用二抗偶联物进行免疫检测 281
    备择方案2 用亲和素生物素偶联的二抗进行免疫检测 282
    基本方案3 用发色(光)底物显迹 282
    支持方案2 膜的清洗和再使用 283
    单元7.8 凝胶和印迹中放射性标记蛋白的检测和量化 283
    基本方案 放射性自显影 283
    支持方案1 固定和干燥用于放射口显影的凝胶 285
    支持方案2 强化屏的使用 286
    备择方案1 荧光显影 286
    支持方案3 光密度计量 287
    备择方案2 磷光成像 287
    第8章 蛋白标记和免疫沉淀 289
    单元8.1 用放射性标记的氨基酸进行代谢性标记 290
    使用35S标记的化合物的安全预防措施 291
    基本方案 35S甲硫氨酸脉冲标记悬浮细胞 291
    备择方案1 35S甲硫氨酸脉冲标记贴壁细胞 292
    备择方案2 35S甲硫氨酸脉冲追踪标记细胞 293
    备择方案3 35S甲硫氨酸长期标记细胞 293
    备择方案4 用其他放射性标记氨基酸进行的代谢性标记 294
    支持方案 TCA沉淀确定标记物的结合量 291
    单元8.2 用放射性标记的糖代谢性标记糖蛋白 295
    基本方案 用放射性标记的糖进行脉冲追踪标记 296
    备择方案 用放射标记的糖进行的长期标记 297
    单元8.3 用放射标记的脂肪酸进行的代谢性标记 298
    基本方案 用脂肪酸进行的生物合成标记 298
    单元8.4 细胞蛋白质的放射性碘化 299
    使用125I标记化合物的安全性预防措施 300
    基本方案1 应用乳糖过氧化物酶对细胞表面进行125I标记 300
    基本方案2 去垢剂溶解的膜蛋白的碘化 301
    支持方案 通过均质化进行膜的制备 302
    基本方案3 乳糖过氧化物酶催化的可溶性蛋白的碘化 302
    单元8.5 免疫沉淀 301
    基本方案1 应用非变性去垢剂裂解悬浮细胞的免疫沉淀 304
    备择方案1 非变性去垢剂溶液裂解贴壁细胞的免疫沉淀 307
    备择方案2 变性条件下去垢剂裂解细胞进行的免疫沉淀 308
    备择方案3 非去垢剂裂解的细胞免疫沉淀 308
    基本方案2 免疫沉淀-回收 308
    单元8.6 酵母蛋白的代谢标记和免疫沉淀 309
    基本方案 酵母蛋白的标记和免疫沉淀 309
    备择方案 制备酵母原生质体 311
    第9章 蛋白质的磷酸化作用 313
    单元9.1 用32P标记培养细胞和制备用于免疫沉淀的细胞裂解物 314
    基本方案 用32P标记的培养细胞和使用温和的去垢剂裂解细胞 311
    备择方案 在SDS中煮沸裂解细胞 315
    单元9.2 磷酸化的免疫检测 316
    基本方案1 应用免疫印迹技术对蛋白质磷酸化的免疫测定 316
    基本方案2 南免疫印迹产生的免疫沉淀物米免疫监测蛋白质的磷酸化作用 319
    基本方案3 组织培养细胞的荧光免疫染色 320
    单元9.3 MAP蛋白激酶信号的检测 321
    基本方案1 通过免疫沉淀反应测定MAP激酶(ERK)的活性 322
    基本方案2 凝胶内激酶测定 321
    基本方案3 JNK测试 325
    支持方案 GST-JUN-谷肮甘肽珠子的准备 326
    第10章 蛋白质转运 328
    单元10.1 用糖苷酶研究蛋白质转运 329
    基本方案1 内切糖苷酶H消化 329
    基本方案2 肽:N-糖苷酶F消化 330
    基本方案3 唾液酸酶(神经氨酸苷酶)消化 331
    基本方案4 埃尔法内切N乙酰氨基半乳糖苷酶 332
    单元10.2 内吞作用 333
    基本方案1 测量转铁蛋白受体在表面和内部间的稳态分布 333
    基本方案2 测量转铁蛋白内化作用动力学 334
    备择方案1 采用125I标记抗体测量膜蛋白内化作用动力学 335
    备择方案2 测量悬浮生长细胞的转铁蛋白内化作用动力学 336
    基本方案3 测量转铁蛋白受体再循环的动力学 337
    支持方案1 带金属离子的转铁蛋白 338
    支持方案2 二铁转铁蛋白的放射性标记 338
    基本方案4 测量液相摄取 339
    支持方案3 通过撤除钾离子来抑制网格蛋白介导的内吞作用 340
    支持方案4 通过胞质酸化来抑制网格蛋白介导的内吞作用 340
    单元10.3 蛋白质转运到质膜 341
    基本方案 采用唾液酸酶消化测定到达细胞表面 341
    备择方案 通过细胞表面分子的生物素化来测量到达细胞表面 342
    单元10.4 极化上皮细胞中的膜转运 313
    基本方案1 转染极化上皮细胞悬液和选择抗性克隆 344
    支持方案1 挑取稳定转染的克隆 315
    支持方案2 在滤器上培养上皮细胞 345
    支持方案3 测量生长在滤器上的单层细胞的泄漏 317
    基本方案2 极化上皮细胞中的脉冲追踪实验 347
    基本方案3 新合成上皮细胞表面蛋白的生物素化 318
    基本方案4 极化上皮细胞蛋白的间接免疫荧光分析 349
    第11章 细胞增殖,细胞衰老和细胞死亡 351
    单元11.1 用流式细胞术确定细胞周期阶段 352
    基本方案1 用碘化丙啶染色的同定化细胞的细胞周期分析 353
    备择方案1 用DAPI染色的固定细胞的细胞周期分析 355
    基本方案2 用PI染色的非同定、去垢剂渗透细胞的细胞周期分析 355
    备择方案2 用DAPI染色的非固定、去垢剂渗透细胞的细胞周期分析 356
    基本方案3 活细胞用Hoechst 33342进行染色 356
    基本方案4 DNA含量和Cyclins D、E、A或B1的二元分析 356
    单元11.2 在细胞周期的特定时期细胞同步化的方法 358
    基本方案1 采用有缝分裂震脱富集有丝分裂细胞 358
    备择方案1 预富集指数生长培养物用于分离有丝分裂细胞 359
    备择方案2 通过诺考达唑阻滞富集有丝分裂细胞 359
    基本方案2 通过血清饥饿富集G0/G1细胞 359
    备择方案3 通过氨基酸饥饿富集G0/G1细胞 360
    基本方案3 用浴伐他汀富集G1期细胞 360
    备择方案4 用含羞草碱阻滞富集G1期细胞 361
    基本方案Ⅱ 通过双重胸苷阻滞使细胞在S期起始处达到同步化 361
    备择方案5 进行连续的G1/S阻滞 362
    支持方案1 测定有丝分裂指数 363
    支持方案2 通过TCA沉淀监测3H胸苷掺入DNA 364
    单元11.3 分析细胞周期中CDK活性和DNA复制 365
    基本方案1 测量CDK活性 365
    基本方案2 用BrdU掺入测量DNA复制 368
    单元11.4 通过DNA片段化和形态学标准评价凋亡和坏死 370
    基本方案1 台盼蓝排斥测量细胞死亡 371
    基本方案2 细胞的差异染色 371
    基本方案3 细胞的Hoechst染色 372
    支持方案 Cytospin制备用于分析的细胞 373
    基本方案4 细胞DNA片段化的TUNEL分析 373
    备择方案1 石蜡包埋切片的TUNEL分析 374
    基本方案5 整个细胞DNA片段化的检测 375
    备择方案2 总基因组DNA的DNA片段化检测 376
    备择方案3 检测DNA片段化的简单方案 377
    备择方案4 用于琼脂糖凝胶电泳的DNA片段的酚抽提 378
    基本方案6 DNA片段的定量分析 379
    基本方案7 用脉冲场琼脂糖凝胶电泳检测高分子质量染色质片段 380
    单元11.5 细胞凋亡期间Caspase活化分析 382
    基本方案1 Caspase活性的酶促分析 382
    基本方案2 用免疫印迹检测Caspase活性 384
    备择方案1 盐酸胍裂解细胞用于免疫印迹 385
    支持方案1 从印迹上去除(剥离)第一抗体和第二抗体 386
    基本方案3 用生物素化底物类似物标记和检测活化的Caspases 386
    备择方案2 用亲和标记测量天然裂解液中的Caspase体外活化 387
    支持方案2 亲和标记活化Caspase特异性控制 388
    支持方案3 d-生物素存在时将膜剥离用于抗体再次杂交 388
    第12章 体外重建 390
    单元12.1 体外翻译 392
    基本方案1 制备和使用依赖mRNA的兔网织红细胞无细胞翻洋体系 392
    基本方案2 依赖mRNA的麦胚无细胞翻译体系的制备和使用 394
    基本方案3 利用协同转录/翻译体系进行体外蛋白质合成 396
    支持方案1 无帽体外转录物的制备 397
    支持方案2 带帽体外转录物的制备 398
    备择方案 用生物素连接的氨基酸进行体外翻译 399
    支持方案3 用链霉亲和素琼脂糖捕获生物素连接的蛋白质 401
    单元12.2 蛋白质共翻译转运进入犬粗面微粒体 401
    基本方案 向犬粗面微粒体的转运 401
    支持方案1 从犬胰腺制备RM 402
    支持方案2 制备EDTA剥离的粗面微粒体 404
    支持方案3 柱洗脱粗面微粒体的制备 404
    单元12.3 体外分析哺乳动物细胞中内质网到高尔基体的物质运输 405
    基本方案1 用半完整细胞重建内质网到高尔基体的运输 405
    备择方案 用半完整细胞重建内质网到高尔基体顺面区域的运输 408
    基本方案2 用哺乳动物细胞微粒体体外重建内质网到高尔基体的运输 408
    基本方案3 内质网膜泡的体外形成和分离 409
    支持方案1NRK细胞微粒体膜的制备 411
    支持方案2 VSV ts045病毒的繁殖 412
    基本方案4 内质网囊泡与高尔基体膜的融合 412
    支持方案3 制备大鼠肝细胞细胞液 414
    支持方案4 从大鼠肝细胞制备高尔基体膜 414
    单元12.4 用洋地黄皂苷透化细胞进行核物质输入 416
    基本方案 贴壁型Hela细胞中的核物质输入 416
    支持方案1 制备非洲爪蟾卵细胞细胞液 417
    支持方案2 制备荧光标记的核输入性底物TRITC-BSA-NLS 419
    支持方案3 制备荧光标记的重组核输人性底物GFP-GST-NLS 420
    单元12.5 非洲爪蟾间期卵提取物的制备和使用 422
    基本方案1 制备分裂间期卵提取物 422
    备择方案1 制备间期细胞的分级分离提取物 424
    支持方案1 用注射方法获得非洲爪蟾卵细胞 424
    基本方案2 用分裂间期卵细胞提取物进行核组装 425
    支持方案2 制备去膜精子染色质作为核组装模板 426
    基本方案3 体外进行核蛋白输入 429
    基本方案4 用连续标记DNA方法分析复制过程 430
    备择方案2 用脉冲标记DNA方法分析复制过程 431
    基本方案5 制备卵母细胞提取物 431
    支持方案3 免疫去除方法去除提取物蛋白质 433
    支持方案4 向提取物中加入目的蛋白 434
    单元12.6 利用非洲爪蟾卵细胞提取物分析细胞周期 434
    基本方案1 制备细胞周期提取物 434
    基本方案2 制备被CSF抑制的提取物 436
    基本方案3 制备有丝分裂提取物 438
    基本方案4 使间期提取物进入有丝分裂 438
    备择方案 在体外生成复制检验点 439
    支持方案1 监测提取物的细胞周期状态 440
    支持方案2 检测组蛋白H1激酶活性 440
    支持方案3 使被CSF抑制的提取物进入间期 441
    单元12.7 有丝分裂纺锤体的体外组装 442
    基本方案1 分析DMSO和中心体的星体反应 442
    基本方案2 分析精子DNA“半纺锤体”反应 443
    基本方案3 分析精子DNA周期性反应 444
    基本方案4 分析DNA磁珠反应 445
    支持方案1 制备CSF提取物 446
    支持方案2 制备罗丹明标记微管蛋白 447
    支持方案3 马达蛋白的破坏 448
    支持方案4 甩片反应 449
    支持方案5 制备DNA包被磁珠 451
    单元12.8 利用非洲爪蟾卵提取物研究细胞凋亡 452
    基本方案 制备凋广提取物并检测凋亡过程 452
    备择方案 将凋亡分成潜伏时相和执行时相 453
    支持方案1 检测Caspase3样活性 454
    支持方案2 利用爪蟾卵提取物制备线粒体 451
    支持方案3 检测细胞色素c的释放 455
    支持方案4 用纯化的线粒体和细胞质检测细胞色素c的释放 455
    单元12.9 体外转录 456
    基本方案 利用核提取物进行体外转录反应 456
    支持方案1 用He1a细胞制备核提取物 457
    支持方案2 制备高盐果蝇核提取物 459
    支持方案3 从分离出的果蝇胚胎核制备可溶性核组分 462
    支持方案4 体外转录产物的引物延伸分析 462
    第13章 细胞黏附与细胞外基质 465
    单元13.1 细胞底物黏附试验 467
    基本方案1 伸展试验 468
    基本方案2 附着试验 469
    支持方案 制备肽蛋白结合物 471
    单元13.2 利用离心力定量测定细胞黏附能力 471
    基本方案 离心细胞黏附试验 472
    单元13.3 依赖钙黏素的细胞细胞黏附 474
    研究策略 474
    基本方案1 短期聚集培养 474
    备择方案 长期聚集培养 476
    基本方案2 混合细胞聚集培养 477
    支持方案1 以TC处理成纤维细胞使细脃解离 478
    支持方案2 以TC处理胚胎细胞使细胞解离 478
    支持方案3 以LTE或TE处理细胞使细胞解离 479
    基本方案3 检测钙黏素和连环蛋白 480
    基本方案4 抑制钙黏素的功能 481
    基本方案5 在钙黏素缺乏或连环蛋白缺陷的细胞系中,恢复钙黏素的活性 482
    单元13.4 分析整合素依赖性黏附 482
    基本方案1 在基于细胞的试验中分析整合素依赖性黏附 482
    基本方案2 固相分析整合素配体相互作用 484
    支持方案1 整合素的纯化 486
    支持方案2 抗体与Sepharose的交联 488
    支持方案3 用生物素标记整合素配体 490
    单元13.5 分析由免疫球蛋白超家族细胞黏附分子所介导的细胞-细胞联系 490
    基本方案1 通过免疫亲和层析技术纯化IgSF-CAM 490
    支持方案1 制备亲和层析柱 491
    支持方案2 溶解膜蛋白 492
    基本方案2 利用荧光微球分析蛋白质的相互作用 493
    支持方案3 将蛋白质与荧光微球相交联 494
    基本方案3 蛋白微球与培养细胞的结合 495
    基本方案4 用骨髓瘤细胞作交互作用试验 496
    支持方案4 用原生质体融合方法对骨髓瘤细胞进行稳定转染 497
    基本方案5 神经突外氏试验 500
    基本方案6 在体外抑制CAM-CAM相互作用 500
    支持方案5 用IgSF-CAM包被细胞培养阻 501
    支持方案6 硝酸纤维素预先包被玻璃表面 502
    单元13.6 纤连蛋白的纯化 502
    基本方案1 纯化血浆纤连蛋白 502
    基本方案2 从培养细胞中纯化纤连蛋白 504
    备择方案1 亲和纯化提取的细胞纤连蛋白 505
    备择方案2 从条件培养基中纯化人细胞纤连蛋白 505
    单元13.7 玻连蛋白的纯化 507
    基本方案 507
    单元13.8 制备胶冻状的基质 509
    基本方案1 制备上型胶原基质 509
    基本方案2 制备Matrigel基质 510
    备择方案1 在Matrigel基质中培养细胞 510
    备择方案2 在体内使用Matrigel基质做血管发生检验和肿瘤生长试验 511
    单元13.9 制备培养的角膜内发细胞和PF-HR9内胚层细胞分泌的细胞外基质 512
    基本方案 制备牛角膜内皮细胞胞外基质(BCE-ECM) 512
    备择方案 制备HR9-ECM 514
    支持方案1 细胞增殖检验 515
    支持方案2 细胞分化检验 515
    单元13.10 制备培养的成纤维细胞产生的细胞外基质 516
    基本方案 制备培养的成纤维细胞产生的细胞外基质 51 6
    支持方案1 细胞附着检测 517
    支持方案2 确定细胞的形状 518
    支持方案3 成纤维细胞来源的三维基质的机械压缩 520
    支持方案4 成纤维细胞来源的三维结构基质的溶解 521
    单元13.11 蛋白聚糖的分离和分析 522
    基本方案1 从培养细胞分离蛋白聚糖 522
    备择方案 分离蛋白聚糖库 523
    支持方案 35SO4或3H葡萄糖胺标记蛋白聚糖 523
    基本方案2 二乙氨乙基-葡聚糖纤维素进行蛋白聚糖的阴离子交换层析纯化 524
    基本方案3 按大小排阻的层析法分析蛋白聚糖 524
    基本方案4 碱性消除法分析葡聚糖胺的大小 525
    基本方案5 用木瓜蛋白酶消化法分析葡聚糖胺的分子质量 526
    基本方案6 用裂解酶降解葡聚糖胺,分析葡聚糖胺的含量和蛋白核心 526
    基本方案7 用硝酸处理法降解硫酸乙酰肝素 527
    基本方案8 分析葡聚糖胺的类型和核心蛋白 527
    基本方案9 分析葡聚糖胺的大小 528
    基本方案10 蛋白聚糖的免疫沉淀 528
    单元13.12 基质金属蛋白酶 529
    基本方案1 活细胞的胶原纤维的溶解和降解 529
    支持方案 制备大鼠尾腱上型胶原 530
    基本方案2 白明胶/干酪素酶水解图谱分析 532
    基本方案3 反向酶水解图谱分析 533
    第14章 细胞的能动性 535
    单元14.1 真核细胞趋化实验 535
    策略设计 535
    基本方案1 滤膜趋化实验 536
    支持方案1 计算无化学吸引剂时细胞迁入厚滤膜的大约距离 538
    基本方案2 琼脂糖下趋化实验 539
    基本方案3 少量细胞趋化实验 540
    基本方案4 桥趋化实验 541
    基本方案5 吸管趋化实验 542
    单元14.2 侵袭实验 543
    基本方案 测量经基质的侵袭 543
    支持方案 准备涂布Matrigel的滤膜 544
    单元11.3 细胞牵引力 545
    基本方案1 检测细胞在起皱底物上的牵引力 545
    支持方案1 校准微型针 546
    备择方案1 用另一种聚合物检测细胞在起皱底物上的牵引力 547
    备择方案2 检测细胞在无皱褶底物上的牵引力 547
    支持方案2 制备改装的喷枪 548
    基本方案2 测量在微机械制造的底物上的细胞牵引力 549
    支持方案3 硅烷化盖玻片 552
    支持方案4 制备偏光反射立方体 552
    单元14.4 细胞损伤实验 553
    策略设计 553
    基本方案 用荧光素右旋糖酐检测培养单层细胞的损伤 554
    备择方案1 用荧光素右旋糖酐检测哺乳动物组织的损伤 555
    备择方案2 以白蛋白作为损伤示踪剂检测细胞损伤 557
    单元11.5 盘基网柄菌属细胞动力学 558
    基本方案1 观察单个活细胞内GFP标记的蛋白质 558
    备择方案1 普遍加入化学吸引剂后的GFP标记蛋白的图像记录 559
    备择方案2 化学吸引剂梯度作用下的GFP标记蛋白的图像记录 560
    基本方案2 聚集细胞群和损伤细胞的GFP标记蛋白的图像记录 561
    支持方案1 质粒构建和转化 561
    支持方案2 细胞在无营养琼脂上发育的表型筛选 563
    第15章 细胞器运动 561
    单元15.1 微管/细胞器运动实验 564
    基本方案 微管/细胞器运动实验 561
    支持方案1 简单灌流室和盖玻片的制备 567
    支持方案2 海胆精子轴丝的制备 568
    支持方案3 猪脑微管蛋白的制备 569
    支持方案4 大鼠肝细胞溶胶的制备 573
    支持方案5 大鼠肝细胞器组分的制备 573
    单元15.2 肌动蛋白通过肌球蛋白移动的体外运动实验 575
    基本方案 分析肌动蛋白通过肌球蛋白的移动 575
    支持方案1 灌流室的制备 577
    支持方案2 肌动蛋白的纯化 578
    支持方案3 罗丹明鬼笔环肽标记的肌动蛋白的制备 579
    单元15.3 植物细胞的细胞器运动:通过绿色荧光蛋白(GFP)使高尔基复合体和内质网的运动成像 580
    基本方案 瞬时表达在树叶内质网和高尔基探针可视化方面的应用 580
    单元15.4 细胞核运动 582
    基本方案 细胞核运动实验 582
    支持方案1 从淋巴细胞分离中心体 585
    支持方案2 浓缩中心体的滴定 587
    支持方案3 制备用于细胞核组装的分裂间期提取物 588
    支持方案4 高速上清液(HSS)的制备 591
    支持方案5 以DNA包被磁珠作为模板组装细胞核 591
    附录 593
    附录1 试剂与溶液 593
    附录2 实用信息和数据 709
    2A 实用测量值和数据 709
    2B 细胞生物学研究中常用的药物概要 710
    2C 放射性同位素的数据 731
    2D 常见荧光的最大吸收和激发波长 738
    2E 离心机及转子 713
    附录3 常用技术 750
    3A 分光光度计测量蛋白质浓度 750
    3B 比色法检测和定量总蛋白 753
    3C 蛋白质溶液的透析和浓缩 766
    3D 用吸收和荧光光谱学定量DNA和RNA 769
    3E DNA的PCR酶促扩增:标准程序和优化 772
    3F 微量RT-PCR 778
    附录4 试剂和仪器设备供应商选录 781
    参考文献 827
    索引 835
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