本书主要内容是对近年来与RNA纳米技术以及它在纳米生物技术和纳米医药的应用直接相关的技术和实验室方案的汇编。涉及的主题包括分析核糖核酸（RNA）结构和性能的各种生物化学、生物物理和生物信息学方法；分析RNA结构的多级装配过程的方法；通过超速离心和高效液相色谱法（HPLC）纯化多功能RNA纳米颗粒；体内RNA 纳米构建物的实时检测；成像、目标定位和治疗效应模块分子结合到RNA支架上；RNA-蛋白质纳米结构的设计和特性描述等。
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前言
第1章RNA纳米技术方法综述——RNA纳米颗粒的合成、纯化及特性 1
1RNA纳米技术的定义 1
2构建多功能RNA纳米颗粒 2
2.1纳米颗粒的RNA支架组装 4
2.2合并功能模块为RNA纳米颗粒 7
3多功能RNA纳米颗粒的纯化和特征 11
3.1凝胶移位分析 11
3.2超速离心法 11
3.3高效液相色谱法 12
3.4RNA纳米颗粒的结构特征 12
3.5RNA纳米颗粒的功能试验 13
4展望 13
5结论 14
致谢 14
参考文献 14
第2章调查细菌小调控RNA自我组装的多种方法 19
1引言 19
2材料 23
2.1试剂 23
2.2缓冲液和溶液 23
3方法 24
3.1用于聚合作用研究的小非编码RNA（sRNA）的体外转录 24
3.2电泳分析sRNA的自组装 25
3.3二级结构预测和sRNA自组装最小序列的特征 25
3.4热变性分析 26
3.5利用近红外光谱分析碱基配对 28
3.6sRNA组装的分子成像 30
3.7粗提物中sRNA聚合物的检测 33
3.8非编码sRNA的RT-PCR定量分析 34
3.9结论 35
4注释 36
致谢 36
参考文献 36
第3章使用AFM测量包含核糖核苷酸的DNA分子的弹性 40
1引言 40
2材料 42
2.1寡核苷酸 42
2.2寡核苷酸上硫醇基的去保护 43
2.3原子力显微镜底衬的制备 43
2.4制备镀金的羧基修饰的氮化硅悬臂 43
2.5在金表面固定DNA底衬 43
2.6原子力显微镜液体电池 44
2.7原子力显微镜和配件 44
3方法 44
3.1制备含核糖核苷一磷酸的DNA寡核苷酸 44
3.2制备双链嵌入式-核糖核苷一磷酸DNA基质 45
3.3制备镀金羧基修饰氮化硅悬臂及含核糖核苷一磷酸的DNA基质的固定化 45
3.4用于测量力的原子力显微镜的校准 46
3.5原子力显微镜液体电池的清洁 47
3.6利用原子力显微镜力光谱测量双链含核糖核苷一磷酸的DNA的弹性 47
3.7数据分析 48
4注释 50
致谢 51
参考文献 51
第4章RNA纳米技术之银纳米簇：RNA纳米颗粒组装的观察以及跟踪的步骤 55
1引言 55
2材料 56
2.1转录和RNA纳米颗粒组装成分 56
2.2Ag:RNA成分 57
3方法 57
3.1RNA合成 57
3.2RNA纳米立方体的组装 57
3.3RNA组装的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳实验 58
3.4合成Ag:RNA 58
3.5Ag:RNA光学测量 58
4注释 59
致谢 60
参考文献 61
第5章利用制备性超速离心大规模纯化RNA纳米颗粒 63
1引言 63
2材料 67
2.1梯度准备 67
2.2超速离心 68
2.3分馏和样品分析 68
3方法 69
3.1CsCl平衡密度法纯化RNA 69
3.2速率区带蔗糖梯度法分离纳米颗粒 70
3.3分馏和样品分析/回收（CsCl和蔗糖的相同） 72
3.4预期结果 73
4注释 73
致谢 75
参考文献 75
第6章HPLC纯化长达59个核苷酸具有单核苷酸分辨率的RNA适配体 78
1引言 78
2材料 80
2.1RNA样品 80
2.2HPLC仪器 81
2.3试剂和缓冲液 81
3方法 81
3.1配制缓冲液 81
3.2初始化和平衡柱子 81
3.3上样 82
3.4再平衡柱子 83
3.5样品处理 83
4注释 83
参考文献 87
第7章在原核和真核细胞中利用具有热力学稳定基序和荧光模块的RNA纳米颗粒实时检测RNA的折叠和翻转 89
1引言 89
2材料 91
2.1体外转录和纯化RNA 91
2.2在E.coli中表达RNA 92
2.3体外和体内MG/DFHBI结合分析 93
2.4动物及人类细胞中RNA表达、折叠和降解的荧光成像 93
3方法 94
3.1融合RNA纳米颗粒的设计 94
3.2通过T7RNA聚合酶体外转录制备RNA纳米颗粒并用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化RNA 95
3.3利用细菌表达、装配和纯化RNA纳米颗粒 95
3.4通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳体外评估RNA折叠 96
3.5通过MG分析，体外评估RNA的折叠 98
3.6通过DHBFI结合分析，体外评估RNA折叠 98
3.7体外监测RNA降解 98
3.8细菌体内RNA折叠的评估 98
3.9真核细胞中RNA折叠的评估 99
3.10在动物和人类细胞中实时检测RNA纳米颗粒半衰期 100
4注释 101
致谢 103
参考文献 103
第8章小RNA3端氧化的荧光标记 105
1引言 105
2材料 106
2.1体外转录组分 106
2.2标记组分 107
2.3凝胶阻滞成分 107
3方法 107
3.1体外转录 107
3.2RNA标记 108
3.3凝胶阻滞分析 109
4注释 109
致谢 110
参考文献 111
第9章RNA纳米颗粒对转移性肿瘤靶向定位及给药的方法和分析 112
1引言 112
2材料 113
2.1试剂 114
2.2设备 115
2.3试剂配制（见注释1） 116
3方法 117
3.1三叉接口（3WJ）自我装配 117
3.2通过激光共聚焦显微镜试验pRNA-3WJ纳米颗粒的细胞结合和内化 118
3.3通过流式细胞仪（FACS）实验检测pRNA-3WJ纳米颗粒的细胞结合（可选） 118
3.4为了产生小鼠皮下移植瘤，皮下注射肿瘤细胞（图9-3） 119
3.5为了产生转移瘤小鼠模型，在脾内注射肿瘤细胞 119
3.6靶肿瘤细胞中荧光RNA纳米颗粒的IVIS光谱在体成像（见注释13） 120
3.7靶标肿瘤组织中RNA荧光纳米颗粒的微观成像 122
3.8用流式细胞仪分析新鲜组织（可选） 122
4注释 123
致谢 124
参考文献 124
第10章RNA纳米颗粒在脑瘤中靶向给药的功能性试验 127
1引言 127
2材料 128
2.1材料 128
2.2设备 129
2.3试剂配制 130
3方法 131
3.1体内合成RNA以及构建RNA纳米颗粒 131
3.2用原子力显微镜成像显示RNA纳米颗粒的结构 131
3.3流式细胞仪分析体外检测叶酸介导的人脑瘤细胞定位（图10-2） 133
3.4荧光共聚焦显微镜体外检测叶酸介导的人癌细胞定位（图10-3） 134
3.5向小鼠模型系统中移植脑瘤（图10-4） 135
3.6利用核磁共振成像（MRI）对小鼠植入脑瘤的定位并测量大小（图10-4） 135
3.7患有脑瘤小鼠的间接体内荧光成像（图10-5） 136
3.8siRNA给药后体内生物荧光全身成像检测脑瘤（图10-6） 137
4注释 138
致谢 140
参考文献 140
第11章适配体介导的纳米颗粒相互作用：从寡核苷酸-蛋白质复合体到SELEX筛选 142
1引言 142
2材料 144
2.1流感病毒基质蛋白-1 144
2.2寡聚核苷酸合成和纯化 144
2.3自动化的SELEX 145
2.4RNA候选的自动化合成 145
2.5Alpha Screen试验 145
3方法 146
3.1SELEX 146
3.2C6（36）适配体的特性：AlphaScreen?的M1复合体 146
3.3C1（36）-M1分析 149
3.4C1（36）-M1-C6（36）夹心试验 149
3.5HAP Iscreen 151
4注释 154
致谢 154
参考文献 154
第12章通过黏性桥组合特异性的适配体siRNA纳米颗粒的方法内化B细胞淋巴瘤 157
1引言 157
2材料 159
2.1细胞系 159
2.2通过体外转录合成BAFF-RR-1和HIV-1gp120A-1对照适配体 160
2.3适配体-黏性siRNA纳米颗粒的结构 161
2.4通过凝胶迁移试验确定分离常数 161
2.5通过激光共聚焦显微镜分析细胞内化 162
2.6RNA抽提 162
2.7利用RT-PCR进行基因沉默 162
2.8通过MTS试验和流式细胞术分析细胞增殖及凋亡 163
2.9siRNA的电转化 163
3方法 163
3.1通过体外转录的BAFF-RR-1和HIV-1gp120A-1控制适配体的合成 164
3.2BAFF-RR-1适配体-黏性-STAT3siRNA纳米颗粒的产生 164
3.3利用凝胶迁移试验测定分离常数 164
3.4利用激光共聚焦显微镜分析细胞内化 166
3.5通过定量RT-PCR分析STAT3siRNA功能 167
3.6通过MTS试验分析细胞增殖 168
3.7利用流式细胞法分析细胞凋亡 168
4注释 169
致谢 170
参考文献 170
第13章一种用于在人黑色素瘤细胞中剪接转换寡核苷酸的功能运输的高通量筛选方法 173
1引言 173
2材料 175
2.1A375pLuc细胞培养和SSO转染 175
2.2荧光素酶检测 175
2.3RT-PCR检测 175
3方法 176
3.1A375pLuc细胞培养和SSO转染步骤（见注释9） 176
3.2荧光素酶检测 176
3.3RNA提取和RT-PCR（见注释10） 177
4注释 179
参考文献 180
第14章RNA-蛋白纳米结构的设计、组装和评估 182
1引言 182
2材料 184
2.1设计 184
2.2合成 185
2.3电泳迁移率试验 186
2.4大气中原子力显微镜 186
3方法 187
3.1设计 187
3.2合成 188
3.3电泳迁移率试验（EMSA） 190
3.4大气中原子力显微镜（AFM） 191
4注释 192
致谢 194
参考文献 194
第15章利用CLIP-Seq技术在病毒中定位RNA和蛋白质的相互作用 196
1引言 196
2材料 199
2.1交联和免疫沉淀组分 199
2.2RNA片段化和提取试剂 200
2.3cDNA文库构建及序列组成 200
3方法 200
3.1紫外交联和RNA片段化 200
3.2免疫沉淀反应和RNA提取 201
3.3cDNA文库构建 203
3.4数据分析 204
4注释 205
致谢 205
参考文献 206
第16章用RCAP、RNA交联和肽段指纹识别技术定位蛋白质RNA相互作用 208
1引言 208
1.1RCAP 209
1.2甲醛交联 209
1.3亲和捕获RNA 210
1.4质谱分析 211
1.5数据分析 211
1.6RCAP数据的独立确定 212
2材料 213
2.1RCAP试验：交联和胰蛋白酶消化试剂 213
2.2RCAP试验：RNA沉淀和重悬浮 213
2.3样品清除 214
3方法 214
3.1RCAP试验：RNA-多肽复共轭对配合物的制备 214
3.2RCAP试验：RNA-肽段复共轭对配合物的沉淀和再悬浮 214
3.3样品处理和质谱分析 215
4注释 215
致谢 216
参考文献 216
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